双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条

来源：学生作业学帮网 编辑：学帮网 时间：2024/05/07 06:48:08

双酶切老是切不完全
我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条带很淡.我的酶切体系是30ul 2种酶各1ul 然后10ul质粒,37度酶切2小时.我确定酶和buffer都没有加错,但为何老是切不下基因呢?

Best reaction for EcoRI is high slat buffer,while HindIII is low salt buffer.Many companies will tell you HindIII would not work well in high salt buffer.I would use high salt buffer,such as New England Buffer 3,for your digestion.Usually it works pretty well.Do not worry too much about HindIII,in most cases you include much much more than necessary enzyme for the restriction.
Good luck.

首先，你看你的载体片段和目标片段的亮度比是不是大约10倍（因为一般T载体大小在2.5K~3k左右），如果是的话，那是正常现象。
如果你能看见线性化的载体或没有切开的载体，那么建议你换一下新开封的酶试试。

双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶切位点,但现在将T载体进行双酶切,缺总是切不完全,只有大约1/3的载体被切开,所以200bp的条 自己设计了一对引物克隆一段基因,PCR出不来结果可能是什么问题? 要克隆一段基因,什么情况用PCR,什么情况用重组质粒分子克隆法? 为什么我的目的基因连接克隆载体转化、提质粒后,酶切鉴定正确,而质粒PCR和菌液PCR鉴定都不正确呢?着急加点 kml?但是我转化后菌落长的还可以啊.酶切目的带在1000左右,质粒PCR在750左右了 为什么我们基因克隆老失败我们做的是拟南芥中一些基因cds的克隆,在设计引物时加上酶切位点,PCR之后通过酶切与载体相连.但是为什么老是失败,起初我们直接切得PCR产物,由于那样切没切开 PCR产物的酶切问题PCR产物进行taqI内切酶酶切鉴定 结果出现了几条杂带 分析原因可能为条带内切不完全导致 昨晚酶切的 4度过夜了 今天我能否对剩余酶切反应液进行二次酶切?若可以酶切反 关于T-A克隆的一些问题我做完了T-A克隆,提取质粒以后,用我的目的基因引物做PCR,跑电泳跑出来了目的条带,但是有一些杂带,是怎么回事呢. DNA分子克隆与PCR扩增DNA的区别T载体是克隆载体,能把目的基因片段转染到大肠杆菌扩增,但不表达.我新手弱弱的问一句为什么不直接把目的片段拿去跑PCR就行了,干嘛要用克隆载体去获得大量 挑克隆鉴定时PCR有目的条带但是酶切没有做分子克隆时,铺板长出很多菌落,于是挑克隆鉴定.PCR扩增目的基因有目的条带,但是酶切重组质粒又只有一条带,酶切时间已经延长至过夜了.挑了好多 pGEM-T载体的通用引物序列有哪些,pcr得到的片段长度是多少使用pGEM－T载体克隆了一段500bp的片段,想通过pcr后再酶切分型,筛选用于测序的样品.但在做pcr的时候不知道采用什么样的引物可以得 我想克隆一个基因.先进行PCR,PCR产物纯化回收,然后连接,转化,一直不成功.回收的片段很亮.我用的是Ex TAQ,他的加A尾效率应该很高了,做T-A克隆应该没有问题,但就是不成功.我还做了平行试验,con 克隆后测序后序列问题我对一株细菌进行PCR后纯化再做克隆,平板上都是白斑,就随机挑出几个培养测序,我是本科生,这个都不懂,测得的结果是由师兄帮我分析的,他通过拼接得到一段序列只有7 已知一基因两侧序列,如何将该基因克隆你没明白我的意思，是要从如何获得目的基因上来回答；比如，知道一段蛋白质的mRNA序列，就用RT-PCR制备出cDNA，从而克隆。现在是知道两侧序列…… PCR扩增后除目的带外还有几条杂带,只切目的带能连上克隆载体吗? 用PCR合成DNA属于克隆吗 如何用pcr分离克隆基因 我的目的基因目前只知道部分序列,现在需要克隆出这个基因全长来,我已经合成了RACE模板及引物,进行了PCR,一直没有出来目的条带 怎么PCR克隆4500bp的DNA长片段想通过PCR设计引物克隆葡萄基因组DNA的4500bp的长片段,可资料上都写着,PCR克隆一般是2000bp,4500bp是不是太长了,能PCR出来吗